第134章 黎明前的测序
第134章 黎明前的测序
徐文培从书房的椅子上站了起来。
他道：
“绕过地方疾控，直接走加急测序通道，得是国家级的公共卫生警报，不可能只凭几个重症病例就越级上报。”
江河迅速汇报：
“患者42岁，既往体健，在48小时内从普通发热进展为双肺大面积实变，血氧跌破88%，更重要的是，接触过他的翻译现在在省人民医院插管，负责打扫他房间的保洁在市八医院昏迷，常规的甲流快筛是阳性，但大剂量的奥司他韦用下去毫无反应。”
徐文培沉默。
过了会，又问：“你确认过流行病学链条吗？”
“嗯，他们在三天内都有明确的时空交集点，现在常规的流程需要市级、省级疾控逐级分离培养，最快也要两到三周才能出全基因组序列，三周时间，广交会数万外商和本地人口足够把这个病毒带到全国甚至全世界。”
江河顿了顿，道：“我只需要您帮我联系病毒病所的核心研究员，把通道打通，证据，我今晚自己做出来发给他们。”
“你自己做？”徐文培眉头紧锁，“你去哪弄p3实验室和测序仪？”
“这个我来解决，只要拿到关键靶点的突变基因序列，我就直接通过邮件发您，有了序列对比，流程就能合法合规提速。”
徐文培站在窗前，无言思量着。
于他而言，一个大三学生，哪怕发了顶刊，但在大流行传染病面前，依然显得过于年轻。
但……江河的忙，自己必须得帮。
“好，我认识病毒病所的舒跃龙研究员，人不错，如果你能拿出证明它不是季节性流感的测序片段，我就有信心说服他让他直接介入。”
“好的，谢谢徐主任。”
挂断电话，江河转身走回医务科办公室。
杨煦和柯正还在等他。
江河：“老师，我想借用孙长明教授的肿瘤研究所中心实验室，全院只有那里有abi 3130xl基因分析仪和高标准的生物安全柜，还有，我需要柯医生立刻去给马克做一次深部支气管肺泡灌洗，把灌洗液样本交给我。”
杨煦看着江河，他意识到自己的学生要干什么了。
随之，惊讶的无以复加。
柯正又震惊又担忧，道：“你要自己做核酸提取和基因测序？可你只是个学生啊，如果在实验室里发生泄露或者暴露怎么办？这违规了吧？”
“所以样本需要柯医生在病房里加入含有硫氰酸胍的裂解液，硫氰酸胍会瞬间使病毒的蛋白质外壳变性，彻底灭活病毒，同时抑制rna酶的活性。”
江河道：“灭活后的样本送到实验室，就不再具备传染性，实验室里的操作只需要常规的生物安全防护级别就足够了，这在流程上没有违规。”
柯正被江河严密的逻辑堵得说不出话来。
杨煦终于从惊讶中缓过神来。
今天晚上，全程开启自动跟随的他，又被自己学生震撼到了。
于是便不再犹豫，站起身，拨通了孙长明的电话。
凌晨两点，电话响了很久才被接起。
孙长明：“老杨？干什么？怕我跟你抢媳妇，也不能不让我睡觉吧？”
杨煦：“长明，借你的中心实验室用一晚，pcr仪、离心机、通风橱、还有abi测序仪，包括冷库里的试剂盒，我全都要用。”
孙长明清醒了些：“你个搞肝胆外科的用什么测序仪？你要干嘛？”
“江河要用。”杨煦说。
电话那头沉默了两秒。
随后，孙长明龙颜大悦：“你同意让江河加入我的实验室了？孺子可教也……”
杨煦：“别开玩笑了，正事。”
“呃……正事吗？抱歉。”
如果是别人，孙长明肯定还要多问几句。
但要借设备的人是江河，孙长明就没多问了。
“……行，我给值班的安保打电话开门，仪器随便用，试剂用多少记下来，让他以后从自己的项目经费里扣。”
“谢了。”杨煦挂断电话，“实验室搞定了，但提取病毒rna和跑pcr是个精细活，一个人一晚上不可能做的完。”
“对，所以我准备叫人。”
江河拿出手机，点开mirna早筛项目组的群聊。
凌晨2:10。
江河：【所有人，看到消息立刻回复，半小时内，附一院孙长明教授肿瘤研究所中心实验室门口集合。】
消息发出去不到三十秒。
陈浩：【收到！我来给所有人打电话！】
程溪瑶：【已经在穿衣服了。】
顾亦舟：【我离得近，五分钟到。】
陆晓林：【收到。】
没有人问为什么，没有人抱怨现在是凌晨两点。
二十分钟后，肿瘤研究所中心实验室大门外。
六个医学生顶着睡眼惺忪的脸，气喘吁吁地跑了过来。
陈浩连扣子都扣错了，程溪瑶的头发随便用皮筋扎在脑后。
江河站在实验室门口等他们。
陈浩问：“老江，大半夜的，出什么事了？嫂子呢？”
江河简单回答：“你嫂子在酒店，附一院有紧急情况，我们要连夜做个研究。”
“啊？”程溪瑶一愣，“嫂子来了？”
“这不是重点吧！”易向晚有些紧张道，“原来是紧急情况吗？可是老大，咱都是新手啊？你怎么不去找附一院检验科的人？”
答案很简单。
检验科的老师们有自己的操作习惯。
如果江河去指挥他们，他们会质疑为什么不加这个试剂，为什么要改那个参数。
沟通成本极高。
但这六个人不同。
过去的一段时间里，江河给他们进行了地狱般的rna提取理论授课。
他们对江河的话言听计从，执行江河的作业程序不会有任何折扣。
所以，江河道：“听好，医院收治了一例极高危的不明原因重症肺炎患者，现在我怀疑是一种新型的重组流感病毒，我们需要在今晚，提取出病毒的rna，逆转录成cdna，跑出pcr扩增片段，然后上机测序，拿到它的基因序列证明。”
六个人：“？？？”
唐培：“老，老大……这什么未知病毒的，我们做……安全吗？”
“送来的样本是经过硫氰酸胍彻底裂解灭活的，它现在只是一堆核酸物质，没有传染性，这和我们前几天培训的提取外周血游离mirna的底层逻辑完全一致，甚至因为我们要提取的是病毒的基因组rna，丰度更高，操作上反而更容易。”
“重点是，防止环境里的rna酶降解样本。”
江河严肃道：“你们是我亲自教出来的，我对你们的实验规范有绝对的信心，今晚的操作，每一步都必须严格按照我教的规范来，不许有任何多余的动作，听明白了吗？”
“明白！”陆晓林年纪最长，第一个出声回应。
“明白了老江，你说咋干就咋干。”陈浩拍了拍脸，让自己彻底清醒。
“去更衣室，穿两层隔离衣，戴双层乳胶手套，n95口罩，护目镜，进核心区。”
凌晨3:15。
柯正提着一个密封的生物安全转运箱来到了实验室门口。
他把箱子交给江河：“江河，这是马克的深部支气管肺泡灌洗液，已经加了裂解液灭活了。”
“好。”
江河接过箱子，转身刷卡进入实验室核心区，立刻说道：
“第一组，陈浩、向晚，你们负责配制试剂，所有的depc水、无水乙醇、异丙醇，全部重新开封新的，确保绝对无rna酶污染，操作台用rnasezap喷洒擦拭两遍。”
“第二组，程溪瑶、唐培，你们负责给所有的移液枪换上带滤芯的枪头，准备好离心管和冰盒。”
“师兄，亦舟，你们俩配合我，准备过柱子提取。”
江河站在超净工作台前，将转运箱打开，取出装有灭活样本的冻存管。
“开始。”
实验室内。
严肃，高效。
这群年纪轻轻的学生，此刻展现出了惊人的纪律性。
这就是培训的成果！
江河拿起一把p1000的移液枪，套上带滤芯的枪头。
“加入trizol试剂，1毫升。”
将样本移入新的离心管中，注入trizol。
透明的液体瞬间混合。
“室温静置5分钟，让核蛋白复合体彻底解离。”
江河看了一眼墙上的挂钟。
五分钟一到。
“加氯仿，0.2毫升。”
“盖紧管盖，剧烈振荡15秒。”
“静置3分钟。”
顾亦舟在一旁已经打开了高速冷冻离心机的盖子，温度已经预冷到了4c。
“放入离心机，配平，12000转，15分钟。”
这15分钟极其漫长。
“滴——”
离心机停止。
江河小心翼翼取出离心管。
在冷光的照射下，管内的液体清晰地分成了三层：
底层是红色的酚氯仿相，中间是一层薄薄的白色蛋白交界面，最上层是无色的水相。
所有的病毒rna，都溶解在这最上层的无色水相中。
江河深吸了一口气，换了一把p200的移液枪。
这一步是整个提取过程中最关键的一步。
如果吸到了中间的蛋白层或者底层的有机相，整个样本就废了。
他将手肘支撑在台面上，按下移液枪的按钮。
枪尖精准悬停在无色水相的中央，缓缓吸取了400微升的液体，移入一个全新的无酶离心管中。
全程，江河的手没有一丝颤抖。
外科医生的定力，在这一刻展现得淋漓尽致。
陆晓林在旁边看得头皮发麻。
——哪怕是浸淫实验室多年的老研究员，悬空吸取水相时也难免会有细微的晃动，但江河的手就像是被焊死了一样，稳得可怕。
“加入等体积的异丙醇，陈浩，递冰盒。”
样本在冰上静置了10分钟后，再次放入冷冻离心机。
12000转，10分钟。
再次取出时，管底出现了一点点半透明胶状沉淀。
“rna沉淀出来了。”程溪瑶隔着护目镜，眼睛亮了起来。
江河：“弃上清，加1毫升75%的冰乙醇洗涤沉淀。”
轻轻悬浮沉淀后，第三次离心。
7500转，5分钟。
最后，用移液枪极其小心地吸走所有的乙醇液体，将离心管敞口放置在超净台的通风处。
“风干5分钟，不能干透，否则很难溶解。”
五分钟后，江河加入20微升rnase-free的水，轻轻吹打。
“去测浓度。”江河把样本递给陆晓林。
陆晓林拿着样本走到nanodrop分光光度计前，取了一微升滴在检测基座上，放下悬臂。
电脑屏幕上立刻跳出一条曲线。
“浓度120 ng/μl，a260/280比值2.02。”陆晓林声音迅速，“师弟，提取极其完美！纯度极高，没有蛋白和苯酚污染！”
陈浩几个人长长地松了一口气，互相对视了一眼。
做到了！
江河毫不犹豫，道：“立刻进行逆转录，rna极易降解，必须马上把它变成稳定的cdna。”
“引物用什么？”陆晓林问。
“用随机六聚体引物（random hexamers）做全转录本的逆转录。”
江河走到冰箱前，拿出逆转录试剂盒：“不需要特异性引物，我们在pcr阶段再用甲流通用的ha（血凝素）和na（神经氨酸酶）保守区引物去钓出目标片段。”
看着手里的试剂，江河眼神微动。
其实，如果这真的是一种完全未知的全新病毒，今晚的这几个小时根本连门槛都摸不到。
光是引物设计就能卡死全中国最顶尖的实验室两周时间。
但他不一样。
他记得h1n1的基因图谱，也知道它的外膜蛋白弱点，包括它最容易被哪种引物扩增。
基本就等同于，拿着标准答案，反向推导解题步骤。
所以效率才能这么高。
逆转录反应体系配制完毕。
放入pcr仪。
42c孵育60分钟，70c加热5分钟灭活逆转录酶。
凌晨5:30。
逆转录完成。
极其脆弱的rna终于变成了相对稳定的dna。
“准备pcr扩增反应。”
“我们要分别扩增它的ha基因、na基因、m基因以及pb1基因片段。”
pcr反应板在江河等人的熟练操作下加样完毕。
放入实时荧光定量pcr仪。
设置热循环程序：95c预变性5分钟，然后进行40个循环的95c变性15秒、60c退火延伸1分钟。
“大概需要一个半小时。”
江河脱下最外层的乳胶手套，看了一眼挂钟。
实验室里的六个学生已经疲惫不堪。
江河走到走廊上，翻出林振华厅长秘书的电话，拨了过去。
电话响了七八声才通。
“王秘书，我是江河，抱歉打扰您休息。”
“嗯……没关系，怎么了？”
“王秘书，我需要您立刻向林厅长汇报，附一院收治了一名墨西哥外商，目前已确认为极高危的不明原因重型肺炎，并且，省人民医院和市八医院在昨晚分别收治了与他有明确密切接触和环境接触的两名重症患者，我判断，这是一起典型的具有极强人传人能力的烈性呼吸道传染病。”
“？？”
躺床上的王秘书翻身而起，直接被吓出冷汗。
“你确定？地方疾控有上报吗？”
“疾控走流程太慢，我目前正在附一院孙长明教授的实验室里跑它的基因测序，现在，我希望省厅立刻动用行政力量，去寻找一辆出租车，司机姓林，三天前搭载过这名墨西哥外商，现在处于失联状态，他极有可能已经发病，如果他在城市里继续活动，后果不堪设想。”
“江河，你目前有确凿的实验室证据吗？”
“证据马上出来，但那个司机，多在外面待一分钟，就会多传染十个人，王秘书，人命关天。”
电话那头沉默了几秒。
“我知道了，我立刻向林厅长汇报，你那边一旦有实验室结果，第一时间通知我！”
江河看着手机，微微松了一口气。
——还好有厅长的联系方式！
早上7:15。
pcr仪扩增结束。
“跑个琼脂糖凝胶电泳看看有没有条带！”陆晓林立刻将pcr产物取出来。
十五分钟后，电泳结果在紫外凝胶成像仪下显现。
屏幕上，在对应扩增片段大小的位置，出现了极其明亮的特异性条带。
没有引物二聚体，没有非特异性扩增。
“漂亮！”陈浩忍不住挥了一下拳头。
江河：“准备测序反应，用纯化柱回收pcr产物，加入bigdye测序试剂，进行测序pcr。”
又是一轮精密操作。
上午10:00。
阳光已经彻底照亮了羊城的天空。
孙长明的实验室里，所有人围在abi 3130xl基因分析仪的电脑屏幕前。
测序的毛细管电泳正在进行最后的信号读取。
屏幕上开始逐一出现不同颜色的荧光峰。
红色、绿色、蓝色、黑色，分别代表着a、t、c、g四种碱基。
“出峰了，基线很平，峰型极其尖锐，测序质量极高。”程溪瑶紧盯着屏幕，眼睛一眨不眨。
随着测序仪的运行，一长串的碱基序列被读取出来，生成了fasta格式的文本文件。
“导出序列数据，陈浩，打开电脑里的blast比对软件。”
陈浩立刻将生成的ha、na、m三个基因片段的序列文件导入本地构建好的流感病毒数据库中进行相似度比对。
进度条快速拉满。
比对结果弹了出来。
陈浩看着屏幕上的英文和数据，愣住了。
“老江……这……这不对啊，这数据库是不是坏了？”
“怎么了？”
“它的ha基因片段，比对出来最相似的是……北美古典猪流感病毒？它的na和m片段，比对出来是欧亚类禽猪流感病毒？然后……它的pb1基因怎么又和人类季节性h3n2流感病毒高度同源？”
陆晓林摇头：“这不可能，猪的病毒、禽类的病毒、人类的病毒……怎么会全部拼凑在同一个病毒株里？我们做错了。”
大家都有些失望。
只有江河，长长地吐出了一口浊气。
——成了。
至于为什么？
原因很简单。
当猪同时感染了禽流感、人流感和猪流感病毒时，它的呼吸道上皮细胞就像是一个天然的混合器。
不同的病毒在这里发生了基因重排，最终诞生了这个集三家之长、对人类有着致命威胁的全新变异体——
甲型h1n1流感病毒。
江河轻声道：“数据库没坏，这是一种前所未见的四重重配新型流感病毒，人类的免疫系统对它完全陌生。”
实验室里，一片死寂。
六个学生呆呆地看着屏幕。
——江河的意思是说，他们刚才，亲手发现了一个新的病毒？
就在这时，江河的手机震动起来。
来电显示：郑立言。
江河接起电话。
“江河，早。”
“郑院士，早上好。”
江河简单阐述了一遍前因后果之后，道：
“……我刚刚跑完测序，结果出来了，北美古典猪流感、欧亚猪流感和人流感的基因片段，在这个病毒体内发生了重排，这是一种四重重配的新型变异株，常规的抗原快筛只能测出甲流阳性，完美掩盖了它的真实身份。”
电话那头的郑立言瞬间没了声音。
当年1918年的西班牙大流感，1957年的亚洲流感，1968年的香港流感……
全都是因为基因重排导致的抗原转变！
而每一次，都带走了数以万计的生命。
郑立言：“你确定测序结果无误？”
江河说：“我立刻把fasta序列文件和blast比对结果发到您的邮箱。”
“好，如果数据属实，我亲自向卫生部汇报。”
信息对接完毕。
江河放下手机，转头看向身后的六个学生。
他们熬了一整夜，但每个人都毫无困意。
因为大家都意识到了，自己正在参与拯救一座城市的计划……
这不是救一个人两个人那么简单。
“陈浩，把测序报告打印出来，我们走。”
“去哪？”
“医务科。”